trong-2.jpg

13/10/2010

Kỹ thuật sinh thiết phôi trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ

ThS. BS. Vũ Bích Thụy
    Khoa Hiếm muộn – BV Từ Dũ

Giới thiệu về chẩn đoán di truyền phôi trước làm tổ 

Chẩn đoán di truyền trước làm tổ (PGD – Preimplantation Genetic Diagnosis) là kỹ thuật dùng để xác định các rối loạn về gen di truyền hay bất thường trong bộ nhiễm sắc thể của giao tử hay phôi ở giai đoạn trước khi phôi bám vào nội mạc tử cung để làm tổ. Quá trình chẩn đoán di truyền trước làm tổ bao gồm hai giai đoạn chính là sinh thiết và chẩn đoán di truyền. Bài viết này giới thiệu về các kỹ thuật sinh thiết và ảnh hưởng của sinh thiết lên sự phát triển của phôi cũng như của các em bé ra đời từ kỹ thuật này.

Kỹ thuật sinh thiết trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ là gì?

Quá trình thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) bao gồm các giai đoạn kích thích buồng trứng, chọc hút trứng, thụ tinh trứng với tinh trùng, sau đó phôi được nuôi cấy và chuyển vào buồng tử cung người mẹ.

Quá trình sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước làm tổ có thể được thực hiện ở 3 giai đoạn khác nhau: sinh thiết trước và ngay sau khi trứng thụ tinh (sinh thiết thể cực thứ nhất và thứ hai), sinh thiết phôi ở giai đoạn phân cắt (ngày thứ 3 sau thụ tinh) hay sinh thiết ở giai đoạn phôi nang (ngày thứ 5 sau thụ tinh). Mỗi giai đoạn sinh thiết đều mang ưu điểm, khuyết điểm cũng như chỉ định riêng. Qui trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngược được gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zona pellucida, dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật ra khỏi trứng hay phôi. Sau đó trứng hay phôi sẽ tiếp tục được nuôi cấy, mẫu vật được cố định để chẩn đoán di truyền.

Yêu cầu kỹ thuật khi thực hiện sinh thiết

1. Chuẩn bị trước sinh thiết 

Các tế bào ngoại lai như tinh trùng, tế bào viền (cumulus cells) cần được làm sạch trước khi sinh thiết nhằm tránh chẩn đoán nhầm DNA của các tế bào này. Do vậy, những bệnh nhân có chỉ định thực hiện chẩn đoán di truyền trước làm tổ cần  được thực hiện TTTON bằng phương pháp ICSI (bơm tinh trùng vào bào tương trứng). Danh tính của trứng, phôi và mẫu vật cũng cần được xác định chính xác và kiểm tra ít nhất hai lần ở mỗi khâu trong suốt quá trình thực hiện nhằm đảm  bảo kết quả chẩn đoán di truyền của mẫu vật được liên hệ chính xác đến trứng  hay phôi tương ứng. Môi trường nuôi cấy và sinh thiết cũng đóng vai trò quan trọng nhằm đảm bảo sự phát triển tiếp theo của phôi. Môi trường sinh thiết giúp quá trình thao tác dễ dàng hơn. Một trong những môi trường quan trọng đó là môi trường không có Ca2+ và Mg2+ (Ca2+ và Mg2+  free medium). Sau đó, phôi cần  được nuôi cấy bằng hệ thống chuỗi môi trường tùy thuộc giai đoạn phát triển (ví dụ như hệ thống môi trường G1, G2 (Vitrolife, Sweden) và được nuôi trong tủ cấy 3 loại khí (5% O2, 6% CO2, 89 %N2) nhằm đảm bảo quá trình phát triển tối ưu của phôi.

Vai trò môi trường không có Ca2+ và  Mg2+ trong sinh thiết phôi 

Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình sinh thiết phôi sẽ dễ dàng hơn khi phôi được ủ trong môi trường không có Ca2+ và Mg2+ vài phút trước khi tiến hành sinh thiết. Ca2+ và Mg2+ đóng vài trò quan trọng trong cấu tạo các liên kết ở màng ngoài các phôi bào. Một trong các liên kết này là Cadherin, đã bắt đầu được hình thành khi phôi giai đoạn 6 phôi bào (khoảng ngày thứ 3 sau thụ tinh), để đến ngày thứ 4, tất cả các phôi bào sẽ liên kết và nén chặt lại thành một khối  thống nhất (compaction).

Cadherin là protein gồm 2 thành phần: phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bên ngoài tế bào là polypeptid gồm có 5 đồng phân (Hình 1).  Các đồng phân này gắn kết với nhau tại các vị trí gắn kết Ca2+ (Ca2+ binding sites) và cũng từ đó gắn kết với các đồng phân cadherin của tế bào lân cận. Nếu  môi trường xung quanh tế bào có nồng độ Ca2+ cao thì phần ngoài của chuỗi cadherin sẽ cứng chắc và mất tính đàn hồi. Ngược lại, nếu môi trường xung quanh tế bào có ít Ca2+ thì phần ngoài của chuỗi cadherin sẽ gắn kết lòng lẻo hơn và dễ bị ly giải bởi các men ly giải protein. Kết quả nghiên cứu của Dumoulin và cs (1998) cho thấy thời gian ủ phôi trong môi trường này quá lâu sẽ làm ảnh hưởng đến sự phát triển tiếp theo của phôi. Do vậy, thời gian ủ phôi cần được giới hạn (dưới 10 phút) và phôi cần rửa sạch nhiều lần trước sinh thiết. Ngoài ra, môi trường không có Ca2+ và Mg2+ có chứa sodium lactate, sodium pyruvate, và alanyl-glutamine cho kết quả có thai sau sinh thiết cao hơn một cách đáng kể so với môi trường không có Ca2+ và Mg2+ đơn thuần . 

  Hình 1: Cấu trúc phần ngoài tế bào của Cadherin
  Copyright © 2002 Bruce Alberts,  Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson

2. Mở cửa sổ màng zona pellucida (zona pellucida opening)

Là phương pháp tạo một lỗ ở màng bao ngoài của phôi (zona pellucida) và từ vị trí ấy, kim sinh thiết được đưa vào bên trong phôi để lấy mẫu vật ra ngoài. Có 3 phương pháp chính được dùng để mở cửa sổ màng zona: phương pháp cơ học, hóa học hay dùng tia laser. Phương pháp cơ học thường được dùng trong sinh thiết thể cực nhưng tương đối phức tạp. Trong khi đó, sử dụng dung dịch acid Tyrode’s trong phương pháp hóa học đơn giản hơn nhưng tỷ lệ phôi bào bị ly giải do bị tiếp xúc với dung dịch acid tương đối cao (11%; Inzunza et al.,1998). Hiện nay, dùng tia laser để mở cửa sổ màng zona được xem là phương pháp đơn giản và dễ sử dụng nhất. Đã có nhiều nghiên cứu so sánh 3 phương pháp trên về hiệu quả lâm sàng cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, nhưng nhìn chung kết quả phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm, kỹ năng cũng như sự khéo léo của người thực hiện.

Màng zona có vai trò quan trọng trong sự phát triển của nang noãn, sự thụ tinh, chống hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng, đồng thời có vai trò như một vỏ bảo vệ phôi khi phôi di chuyển từ vị trí thụ tinh ở tai vòi vào buồng tử cung để làm tổ. Màng zona có cấu trúc là chất nền glycoprotein (glycoprotein matrix), carbonhydrate và protein chuyên biệt của màng zona với bề dày bình thường là 13-15 µm. Độ dày màng zona sẽ mỏng dần tương ứng với sự phát triển của phôi, và  đến ngày 5-6 sau thụ tinh, màng zona sẽ vỡ ra để phôi thoát ra ngoài (hatching). Quá trình thoát màng chịu ảnh hưởng của 3 yếu tố chính: sự tăng trưởng của khối tế bào phôi ở giai đoạn phôi nang, sự tiết men ly giải màng zona của phôi bào và tế bào nội mạc tử cung.

Thực nghiệm cho thấy tỷ lệ làm tổ của phôi tăng sau mở cửa sổ màng zona khi phôi ở giai đoạn phân cắt. Nguyên nhân có thể là do quá trình này đã kích thích phôi bào tăng sản xuất men ly giải màng zona. Tuy nhiên, mở cửa sổ màng zona có thể dẫn đến các bất thường thoát màng như phôi bào tự thoát qua cửa sổ, hiện tượng thoát màng sớm, thoát màng một phần hay phôi bị “mắc kẹt” ở cửa sổ khiến phôi bị chia đôi dẫn đến  hiện tương song thai cùng trứng.

Năm 1991, Cohen và Feldberg nghiên cứu thấy kích thước và số lượng cửa sổ được mở ở màng zona ảnh hưởng đến quá trình thoát màng của phôi. Kenichiro và cs (2008) đánh giá hiệu quả lâm sàng của kích thước cửa sổ màng zona ở phôi nang cho thấy tỷ lệ thai, tỷ lệ làm tổ và tỷ lệ trẻ sinh sống ở nhóm mở cửa sổ đường kính 40 µm là 43%, 27% và 38% và ở nhóm mở cửa sổ có đường kính ½ chu vi màng zona là 74%, 52% và 65% so với nhóm đối chứng là 17%, 10% và 13% (p < 0.05).  Nếu cửa sổ màng zona mở quá to, toàn bộ phôi sẽ có nguy cơ thoát ra ngoài khi thao tác trên  phôi hay chuyển phôi. Ngược lại, nếu cửa sổ quá nhỏ, nguy cơ song thai cùng trứng sẽ tăng. Alikani và cs (2003) báo cáo tỷ lệ song thai cùng trứng ở những ca thực hiện phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng là 0.55% (P < 0.05). Tuy  nhiên, số liệu thống kê của Cochrane 2003 từ 23 thử nghiệm lâm sàng  ngẫu nhiên có đối chứng cho thấy chưa có mối tương quan rõ ràng giữa song thai cùng trứng và kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng. Do vậy, nguyên nhân của sự gia  tăng tỷ lệ có thai là do bản thân quá trình TTTON (kích thích buồng trứng, môi trường nuôi cấy phôi…) hay do tác động lên màng zona cần được xác định qua nhiều thực nghiệm lâm sàng hơn.

3. Sinh thiết mẫu vật


Sinh thiết thể cực  
Sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt 
Sinh thiết phôi nang
Hình 2: ba giai đoạn thực hiện sinh thiết phôi 

         

Sau khi mở cửa sổ màng zona, kim sinh thiết được đưa qua cửa sổ để vào khoang dưới màng zona (perivitelline  space). Đường kính trong của kim sinh thiết phụ thuộc vào loại mẫu vật muốn sinh thiết. Với sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt, đường kính trong của kim sinh thiết thường từ 35-40 µm. Có hai phương pháp chính để lấy mẫu vật ra ngoài. Thứ nhất là tạo áp lực âm trong kim sinh thiết để hút phôi bào vào kim sinh thiết. Phôi bào có thể được hút toàn bộ hay một phần. Nếu phôi bào chỉ được hút một phần vào kim thì cần có thêm lực kéo để nhẹ nhàng vừa hút vừa kéo phôi bào ra ngoài. Cách này thường được ứng dụng nhiều nhất trên lâm sàng. Phương pháp thứ hai, ít được sử dụng hơn, là tạo một áp lực dương từ kim sinh thiết (ví dụ như đẩy môi trường vào khoang dưới màng zona, vặn xoắn bên ngoài  màng zona) để đẩy phôi bào ra cửa sổ màng zona. Đối với sinh thiết phôi nang, khoảng 10-30 “tế bào ngoài” của phôi (trophectoderm) được hút ra ngoài qua cửa sổ màng zona, sau đó liên kết giữa khối tế bào bên ngoài và bên trong sẽ được cắt bằng phương pháp cơ học hay bằng tia laser.

Phương pháp sinh thiết thể cực được xem là phương pháp ít gây tổn hại, ít ảnh hưởng đến sự sống và chất lượng của  trứng và phôi nhất. Tuy nhiên, kết quả chẩn đoán di truyền thể cực chỉ phản ánh sự bất thường di truyền của người mẹ mà thiếu đi thông tin di truyền của người cha và của phôi. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền phôi ở giai đoạn phôi nang  được xem là kỹ thuật mang lại kết quả di truyền chính xác nhất hiện nay với ưu điểm là nhiều tế bào được sinh thiết và chẩn đoán. Đồng thời, khi áp dụng  phương pháp này, do khối phôi bào vẫn được bảo tồn nên sự phát triển tiếp theo  của phôi không bị ảnh hưởng. Tuy nhiên, chuyển phôi tươi không thể thực hiện trong sinh thiết phôi nang nên sau khi sinh thiết, phôi nang phải được trữ lạnh để chờ chu kỳ chuyển phôi tiếp theo. Trong khi đó, nếu sinh thiết phôi ở giai  đoạn phân cắt, phôi được chẩn đoán di truyền bình thường sẽ được nuôi thêm 2 ngày để đến giai đoạn phôi nang và được chuyển phôi vào ngày 5 của quá trình  TTTON. Do ưu điểm nêu trên nên hiện nay, sinh thiết phôi ngày 3 được sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, tỷ lệ thể khảm (mosaicism) ở phôi nang và phôi giai đoạn phân cắt tương đối cao là một trong những bất lợi trong chẩn đoán di truyền phôi trước làm tổ .

Trong sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt, số lượng phôi bào sinh thiết tùy thuộc vào mục đích chẩn đoán di truyền.  Ví dụ như sinh thiết 1 phôi bào để chẩn đoán dị bội của một số cặp nhiễm sắc thể (NST) xác định, sinh thiết 2 phôi bào để chẩn đoán các bất thường liên quan  đến NST giới tính hay một số bất thường về chuyển đoạn, đảo đoạn NST. Như vậy câu hỏi được đặt ra là sinh thiết 1 hay 2 phôi bào có ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi hay không? Thực nghiệm so sánh quá trình phôi bào được lấy ra trong sinh thiết tương đương với phôi bào chết sau khi rã phôi trữ do Cohen và cs (2007) tiến hành cho thấy chu kỳ chuyển phôi sau rã không có phôi bào chết cho tỷ lệ có tim thai là 30% so với chu kỳ chuyển phôi có 25-50% phôi bào chết là 13,7% (Bảng 1). Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy sinh thiết một phôi bào ít làm giảm khả năng làm tổ của phôi, tuy nhiên sinh thiết hai phôi bào có thể làm giảm hơn 50% khả năng làm tổ của phôi. Và đương nhiên, kỹ năng và kinh nghiệm của người sinh thiết cũng đóng vai trò rất quan trọng.

 Bảng  1: Tác động của phôi bào chết sau rã phôi lên sự làm tổ

Hiệu quả chẩn đoán di truyền
Kể từ khi ra đời năm 1990, phương  pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ đã được thực hiện tại nhiều trung tâm điều trị hiếm muộn trên thế giới. Kết quả một nghiên cứu đoàn hệ được thực hiện trong vòng 7 năm (1992-2005) đánh giá sức khỏe của các em bé ra đời bằng phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ ở phôi ngày thứ 3 sau ICSI cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỷ lệ đa thai, tuổi thai, cân  nặng và tỷ lệ bất thường lớn (major malformation rates) sau sinh của 581 em bé ra đời từ pháp này trong số 2889 em bé ra đời bằng phương pháp ICSI đơn thuần. Tỷ lệ bất thường lớn chung là 2,13 and 3,38% (OR: 0,62 (0,31–1,15)). Tuy nhiên, tỷ lệ trẻ chết chu sinh trong nhóm thực hiện chẩn đoán di truyền trước làm tổ cao hơn nhóm chứng (4.64% so với 1,87% (OR 2,56 (1,54–4,18)). Do vậy, quá trình sinh thiết phôi không phải là yếu tố nguy cơ gây ảnh hưởng tiêu cực đến trẻ sinh ra từ phương pháp này.
 
Kết luận  

Phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ nhằm giúp lựa chọn phôi không mang một số bất thường di truyền xác  định. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền là hai quá trình quan trong trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ. Thể cực, phôi bào hay tế bào ngoài phôi có thể được sinh thiết để chẩn đoán di truyền tùy theo từng chỉ định cụ thể. Nhiều  nghiên cứu trong vòng 20 năm qua cho thấy quá trình sinh thiết 1 phôi bào không làm ảnh hưởng đến khả năng làm tổ cũng như sự phát triển của các em bé sinh ra từ phương pháp này. Tuy nhiên, cần có nhiều nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng ở diện rộng hơn nhằm đánh giá chính xác hiệu quả của phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ.

Tài liệu tham khảo

 1. Dumoulin JCM, Bras M, Coonen E, Dreesen J, Geraedts JPM, Evers JLH. Effect of Ca/Mg-free medium on the biopsy procedure for preimplantation genetic diagnosis and further development of human embryos. Hum Reprod 1998;13:2880–3.

2. Hill D, Li M. Embryo biopsy medium and PGD  pregnancy rates. Clin Embryol 2004;7:11–2. Inzunza J, Iwarsson E, Fridstrom M, et al. 1998. Application of single-needle blastomere biopsy in human preimplantation genetic diagnosis. Prenat Diagn 18: 1381–1388.

3. Letterie, G.S. (1997) Assisted hatching: Rationale, technique, and clinical outcomes. Assist Reprod, Reviews 8: 116–125.


4. Cohen, J., M. Alikani, J. Trowbridge, Z. Rosenwaks (1992) Implantation nhancement by selective assisted hatching using  zona drilling of human embryos with poor prognosis. Hum Reprod 7: 685–691

5. Cohen, J., D. Feldberg (1991) Effects of the size and number of zona pellucida openings on hatching and trophoblast  outgrowth in the mouse embryo. Mol Reprod Dev 30: 70–78.

6. Kenichiro H., Megumi F., Kaori H., Toshitaka  H., Tomoyo M., Masayuki K. & Kazuo K. (2008) Effect of the size of zona  pellucida opening by laser assisted hatching on clinical outcome of frozen cleaved embryos that were cultured to blastocyst after thawing in women with multiple implantation failures of embryo transfer: a retrospective study. J  Assist Reprod Genet, 25, 129-135.

7. Alikani M, Cekleniak N, Walters E, Cohen J.  Monozygotic twinning following assisted conception: an analysis of 81  consecutive cases. Hum Reprod. 2003; 18: 1937–1943.

8. Edi-Osagie EC, Hooper L, McGinlay P et al. Effect(s) of assisted hatching on assisted conception (IVF & ICSI).  Cochrane Database Syst Rev. 2003; 4: CD001894.

9. Ruangvutilert P, Delhanty JD, Serhal P,  Simopoulou M, Rodeck CH, Harper JC. 2000. FISH analysis on day 5  post-insemination of human arrested and blastocyst stage embryos. Prenat Diagn  20: 552–560.

10. Cohen J, Wells D, Munn_e S. Removal of two  cells from cleavage stage embryos is likely to reduce the efficacy of  chromosomal tests employed to enhance implantation rates. Fertil Steril  2007;87:496–503.


11. Liebaer I., Desmyttere S., Verpoest W., De  Rycke M., Staessen C., Sermon K., Devroey P., Haentjens4 P. & Bonduelle M. (2010) Report on a consecutive series of 581 children born after blastomere biopsy for preimplantation genetic diagnosis. Human Reproduction, 25, pp275-282