Sàng lọc nhiễm Human Papillomavirus (HPV) ở cổ tử cung bằng phương pháp PCR: ưu điểm của việc nhắm đến vùng E6/E7
ThS.BS. Lê Quang Thanh
Bệnh viện Từ Dũ
Lược dịch theo
Brian J. Morris. Cervical human papillomavirus screening by PCR: advantages of targeting the E6/E7 region. Clin Chem Lab Med 2005;43(11):1171–1177
Tóm tắt
PCR là một phương pháp đầy hứa hẹn để phát hiện nhiễm HPV, mà các tuýp nguy cơ cao có thể gây ra căn bệnh ung thư cổ tử cung. Chất mồi PCR nhắm đến vùng L1 hoặc E1 có thể không đáng tin cậy và có thể bỏ sót nhiều trường hợp bệnh tiến triển, trong khi các chất mồi nhắm trực tiếp vào khu vực E6 hoặc E7, đây là vùng mã hóa các tác nhân gây ung thư, được ưa chuộng hơn bởi vì: 1) vùng L1/E1 bị mất khi có sự tích hợp ADN của virus vào ADN của ký chủ, trái lại vùng E6/E7 không bao giờ bị mất, đây là tiến trình đặc trưng không thể thiếu của diễn tiến từ nhiễm HPV đến tạo u; và 2) trình tự nucleotide E6/E7 cho thấy ít biến động nucleotide hơn. Sự lựa chọn vùng để sử dụng kỹ thuật PCR có ý nghĩa đối với các chiến lược sàng lọc HPV trong chẩn đoán lâm sàng và xử trí ung thư cổ tử cung.
1. Mở đầu
Thực tế là 100% bệnh ung thư cổ tử cung là do các tuýp HPV nguy cơ cao gây nên (1,2), có nghĩa là phương pháp phát hiện tin cậy có liên quan đáng kể đến chẩn đoán và tiên lượng. Các phương pháp thông thường nhất hiện nay để phát hiện virut đều sử dụng kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, các xét nghiệm PCR thường chỉ nhắm đến vùng 100-500 bp để khuếch đại, trong khi đó hệ gen của HPV là 7,9 kb, có nghĩa là có nhiều lựa chọn về vùng để khuếch đại. Điều quan trọng nhất là có sự khác biệt về đặc tính sinh học và đặc điểm trình tự của các vùng khác nhau, do đó sự lựa chọn vùng mục tiêu là then chốt để kỹ thuật PCR phát hiện HPV có kết quả đáng tin cậy. Trong tổng quan này, tôi xem xét các lựa chọn và giải thích tại sao một số chiến lược phổ biến hiện đang sử dụng có thể dẫn đến kết quả âm tính giả, dẫn đến những tác động lâm sàng nghiêm trọng.
2. Sự tích hợp virut
+ Các dạng vật lý của HPV ADN:
Bộ gen HPV bao gồm vùng điều hòa ngược dòng (URR), hoặc vùng kiểm soát dài (LCR), vùng gen sớm ( E1, E2, E6 và E7), và vùng gen muộn (L1 và L2) (3). Hơn nữa, cần lưu ý là các có sự chồng lấn ở các vùng liền kề: ví dụ, E6, lớn hơn E7, chồng lấn một phần đáng kể với E7 .
Sau quá trình nhiễm bệnh của một tế bào biểu mô cổ tử cung, vòng ADN HPV lúc đầu vẫn còn tự do bên trong tế bào. HPV tuýp nguy cơ thấp (tuýp 6 và 11) vẫn duy trì ở dạng bổ sung này (4,5). Điều này cũng áp dụng đối với tuýp nguy cơ cao ở tân sinh trong biểu mô cổ tử cung 1 (CIN1), và thường xuyên trong CIN2 và CIN3 (6,7). Tuy nhiên, trong các dòng tế bào ung thư cổ tử cung, ADN của virut thường được tích hợp vào hệ gen của tế bào (8-11). Sự tích hợp là phổ biến, tiền đề của sự phát triển ung thư, và có thể liên quan đến sự biến đổi ác tính (2,6,12). Quan trọng nhất, liên quan đến sàng lọc, sự tích hợp dẫn đến mất những vùng lớn, thường liên quan nhất đến E2 và E1, nhưng cũng có thể là L1 và L2, và ADN HPV được tích hợp còn lại có thể là dạng duy nhất hiện diện trong tế bào bị nhiễm bệnh. Điều này đặt ra một trở ngại lớn cho các kỹ thuật PCR có liên quan đến chất mồi nhắm đến bất kỳ vùng nào mà thật ra đã bị mất đoạn.
+ Tích hợp virut và bệnh ung thư
Trong tế bào ung thư bị nhiễm HPV16, cả hai dạng bổ sung và tích hợp, các mảng đầu đến đuôi của ADN HPV đã được tìm thấy (13). Đối với ung thư cổ tử cung chứa HPV16, một nghiên cứu cho thấy 44% đã tích hợp, 44% dạng bổ sung và 11% có cả hai dạng ADN HPV (14). Trong một nghiên cứu khác, 8/34 trường hợp ung thư xâm lấn chỉ có dạng tích hợp (15). Một nghiên cứu khác cũng phát hiện 11/25 chỉ có HPV tích hợp (16). Số lượng nhiều của ADN HPV16 có liên quan với sự tiến triển nhanh chóng của tổn thương CIN (17). Trong trường hợp của HPV18, ADN HPV đã được tích hợp và khuếch đại trong ba dòng tế bào (18), và trong ung thư, sự phối hợp của 2 dạng tích hợp và bổ sung của HPV16 đã được quan sát thấy (19). Trong 68 trường hợp ung thư cổ tử cung, 75% có AND của HPV 16 hoặc 18, 7% có dạng bổ sung và 18% cho mỗi dạng (20). Ước tính ban đầu là 36-71% cho dạng bổ sung, 22-39% cho dạng tích hợp, và 6-25% cho cả hai dạng (21). Một phương pháp liên quan đến real-time PCR đã được sử dụng để sàng lọc tình trạng tích hợp bằng cách xác định tỷ lệ E2/E6 và có thể phù hợp để giám sát tiến triển của bệnh (17).
+ Tích hợp virut và tiền ung thư
Trong trường hợp loạn sản, một báo cáo ban đầu đã lưu ý đến sự tích hợp của ADN HPV16 trong 86% trường hợp, nghĩa là, xảy ra trong giai đoạn tiền ung thư (22). Trong các mẫu CIN, dạng tích hợp đã được tìm thấy trong 3/7 trường hợp dương tính với HPV16 (19). Có khả năng là sự tích hợp là một đặc tính của sự tiến triển đến ác tính đã được nêu bật trong một nghiên cứu cho thấy HPV được tích hợp trong 3% trong số 100 mẫu sinh thiết CIN, nhưng đến 81% trong số 69 trường hợp ung thư (6). HPV16 là phổ biến nhất (58%), và trong số này, 72% có tích hợp và 27% chỉ là dạng ADN HPV bổ sung. Trong số các trường hợp có dạng tích hợp, 80% chỉ là dạng ADN của virut hiện diện trong tế bào, với chỉ 20% có cả hai dạng bổ sung và tích hợp. Một nghiên cứu gần đây cho thấy HPV tích hợp (chủ yếu là HPV16 ) trong 80% trường hợp CIN3, 63% trường hợp CIN2 và 36% trường hợp CIN1 (23). Sự vắng mặt của dạng bổ sung (nghĩa là dạng tích hợp đầy đủ) là 36%, 25% và 7% ở từng giai đoạn tương ứng. Tỷ lệ của dạng tích hợp so với bổ sung không khác nhau trong từng giai đoạn, cũng như tải lượng virut (23).
+ Tích hợp của HPV16 so với HPV18
Trong nghiên cứu nói trên (20), 51 trường hợp ung thư cổ tử cung có HPV16, 71% chỉ có dạng tích hợp, 20% có cả dạng tích hợp và bổ sung, và 10% chỉ có dạng bổ sung, trong khi đó tất cả 17 trường hợp ung thư chứa HPV18 chỉ có dạng tích hợp. Sự khác biệt này là do đặc tính tiến triển mạnh và nhanh của chứng loạn sản liên quan đến HPV18, và do đó rất thích hợp với xét nghiệm sàng lọc. Tương tự như vậy, các nghiên cứu khác cho thấy trong 23 trường hợp ung thư có HPV18, có hiệu lực biến đổi lớn hơn, tất cả có ADN HPV tích hợp, với chỉ một trường hợp có cả ADN dạng bổ sung (6).
+ Vị trí gen tích hợp
Tích hợp liên quan đến sự đứt đoạn của ADN HPV và mất một phần của bộ gen. Quan sát ban đầu về các dòng tế bào ung thư cổ tử cung cho thấy sự mất đoạn 2-3 kb trong đó bao gồm các vùng E2 đến L2 (18). Quan trọng là, sự sao chép E6- E7 có thể được phát hiện trong các tế bào. Người ta còn phát hiện ra rằng khung đọc mở (ORF) E1, E2, E4 và E5 đã bị gián đoạn do ADN tế bào chủ bị xâm nhập, chỉ ra những vị trí này là các vị trí tích hợp (24). mRNA HPV biểu hiện sự lai với đoạn dò cho toàn bộ ORF E6 và E7 và một phần nhỏ ORF E1, điều này cho thấy đây là những phần có hiện diện của gen HPV. Không phát hiện được sự lai ORF L1 và L2, cho thấy các vùng này đã bị đứt đoạn hoặc không còn được sao chép. Tương tự như vậy, trong một nghiên cứu về sáu mẫu ung thư cổ tử cung, vùng E6/E7 được thấy vẫn giữ dạng tích hợp, nhưng vùng E2 đã bị mất (25). E2, cũng như hầu hết E1, cũng bị mất đoạn trong ung thư cổ tử cung có chứa ADN HPV16 (26). Việc kiểm tra một dòng tế bào cho thấy sự tích hợp làm xáo trộn E2 và L2 đã được phát hiện xảy ra trong tổn thương tiền ung thư bắt nguồn từ dòng tế bào này (27).
Trong một nghiên cứu bốn dòng vô tính có ADN HPV16 tích hợp và mất đoạn trong các vùng E1/E2 và L1/L2, không vị trí tích hợp đặc hiệu nào hiện diện trong giải trình tự virut (28). Thay vào đó, trong quá trình tích hợp, trình tự virut được mở bên trong ORF bất kỳ, ngoại trừ ORF E6/E7 và vùng kiểm soát tại chỗ. Tích hợp bộ gen của virut vào ADN của nhiễm sắc thể ở người ở các tế bào ung thư thường phá vỡ hoặc mất đoạn ORF E2, dẫn đến sự mất biểu hiện của gen E2, nhưng lại có liên quan đến tiếp tục biểu hiện cao của E6 và E7 (29) .
+ Vị trí gen đối với đột biến
Một chiến lược sàng lọc HPV khác bằng PCR là các đột biến của ADN HPV xảy ra trong vùng L1 của bộ gen HPV, nhưng tần suất thấp hơn trong vùng E6. Điều này có thể ảnh hưởng đến độ trung thực của chất mồi PCR và do đó ảnh hưởng đến khả năng phát hiện sự hiện diện của HPV.
Ví dụ, ung thư cổ tử cung dương tính với HPV16 chỉ có 3091 bp trong số 7905 bp gốc của gen virut còn lại (30). Điều này bao gồm vùng E6/E7. Quan trọng hơn, trong khi ORF E6 và E7 cho thấy sự phù hợp hoàn toàn với các trình tự đã được công bố (đồng thời cũng ủng hộ vai trò của E6/E7 trong quá trình tạo u) , đã có nhiều đột biến (dị hóa, chuyển đoạn, mất đoạn nhỏ, và chèn đoạn nhỏ ) trong ADN HPV16 tích hợp còn lại, mà bao gồm các phần của ORF L1 và E1. (Đầu 5' của L1 bị mất, ADN tích hợp bắt đầu từ nt 6334). Các đột biến bao gồm: sự mất gốc đơn tại nt 6387, sự chèn nucleotide của CAT ở vị trí 6901 [cũng đã được ghi nhận ở các nghiên cứu khác (26,31,32)] và mất đoạn của trình tự GAT tại nt 6949.
+ Tại sao tích hợp xảy ra?
Sự tích hợp của ADN HPV16 dẫn đến tăng mRNA ở trạng thái ổn định mã hóa các gen của virut sinh ung E6 và E7 như một hậu quả của việc gia tăng sự ổn định gây ra bởi sự gián đoạn của trình tự giàu A + U ở vị trí 3'- UTR của mRNA E6 và E7 và thay thế bằng trình tự tế bào với hàm lượng A + U thấp hơn (33). Điều này sẽ chiếm, ít nhất một phần, nồng độ protein E6 và E7 cao hơn ở các quần thể vô tính với ADN HPV16 tích hợp so với các quần thể trong đó ADN chỉ hiện diện ở dạng bổ sung (29). Do đó, các tế bào với ADN tích hợp phát triển nhanh hơn các tế bào chỉ có ADN HPV bổ sung, nghĩa là, sự tích hợp đem lại lợi thế tăng trưởng (29).
Sản phẩm protein của E6 liên kết p53, một chất điều biến âm quan trọng của chu kỳ tế bào, và trong quá trình này ức chế hoạt tính của nó, dẫn đến tăng trưởng không kiểm soát được. Điều này cung cấp cơ sở sinh học cho sự phát sinh ung thư. Tương tự như vậy, protein E7 gắn vào chất điều biến chu kỳ tế bào quan trọng, protein gắn kết nguyên bào võng mạc. Gen E2 mã hóa protein gắn kết ADN đặc hiệu vị trí điều biến chất hoạt hóa HPV và cũng trực tiếp biểu hiện E6 và E7 (34-36) . Trong ung thư cổ tử cung, vấn đề ở đây là vùng E6 và E7. Phần còn lại của bộ gen có thể có vai trò trong sự lây truyền của virut vào tế bào mới của ký chủ, nhưng gây ra bệnh ung thư là protein được mã hóa bởi E6 và E7. Sự tích hợp của ADN HPV xảy ra sớm trong quá trình phát triển ung thư và đóng vai trò quan trọng như cơ chế kích hoạt sự tiến triển từ tiền ung thư sang ung thư (2,6,12).
3. Phương pháp phát hiện HPV bằng PCR
Như vậy, làm thế nào để tất cả điều này ảnh hưởng đến quyết định về cách tiếp cận phát hiện HPV bằng PCR?
+ PCR liên ứng L1
Phương thức này cũng được gọi là chất mồi ''liên ứng'' nhắm vào vùng được bảo tồn cao L1 của bộ gen HPV. Cần có thêm một bước sau đó, chẳng hạn như dò với oligonucleotide đặc hiệu loại được dán nhãn phóng xạ hoặc bioti để giải quyết các vấn đề quan trọng của loại HPV hiện diện. Tập hợp chất mồi liên ứng bao gồm các chất hướng vào các phần khác nhau của vùng L1, tức là các chất đã được đặt tên bởi những người phát hiện ra chúng MY09 - MY11, GP5 - GP6, GP5 + - GP6 +, và oli- 1b-oli-2I, và những chất hướng vào vùng E1, tức là CpI- CpIIG (37). Bộ chất mồi MY09/MY07 (MY-PCR) (38) và bộ chất mồi GP5 +/GP6 + ( GP +-PCR ) (39) thường được sử dụng để phát hiện HPV trong mẫu bệnh phẩm. Tập chất mồi thứ hai là cải biến (mở rộng chiều dài) của một phiên bản trước đó, GP5/GP6, được thiết kế để khuếch đại vùng nt 6624-6765 của bộ gen HPV để tạo ra sản phẩm 140-150 bp (40). Tập MY- PCR khuếch đại vùng nt 6582-7033 để tạo ra sản phẩm 450 bp (38). Tập chất mồi MY-PCR được tổng hợp với một số nucleotide thoái biến trong mỗi chất mồi và do đó là một tổ hợp gồm 25 chất mồi có khả năng khuếch đại một phổ rộng các loại HPV (38,41). Trái lại, chỉ có hai chất mồi trong bộ GP + -PCR và phát hiện một loạt các HPV có thể đạt được bằng cách sử dụng nhiệt độ ủ thấp hơn trong PCR (39). Chất mồi MY09/11 ưu tiên khuếch đại một vài HPV nhất định (1,42), do đó bỏ qua các tuýp khác có thể hiện diện. Tuy nhiên, mặc dù hệ thống MY09/11 và GP5 + /GP6 + tạo ra một tỷ lệ gần như giống hệt nhau của HPV trong một tập hợp các mẫu lâm sàng, chất mồi MY09/11 phát hiện các mẫu với nhiều loại HPV hơn hai lần so với các chất mồi GP5 +/GP6+ (43). MY-PCR được sử dụng nhiều ở Mỹ và châu Á, và GP + -PCR ở châu Âu , phản ánh khu vực địa lý mà mỗi bộ được phát triển.
Thay vì các thoái biến ngẫu nhiên, inosine, mà phù hợp với bất kỳ nucleotide nào, có thể được kết hợp vào một loạt các gốc hướng vào khu vực mục tiêu tương tự. Điều này cho phép tối ưu PCR, chứ không phải là thấp, nhiệt độ ủ. Ví dụ là các gốc PGMY (42,44) và SPF10, mà tạo ra các amplicon ~ 450 và 65 bp tương ứng, và về mặt kỹ thuật tốt hơn và dẫn đến tỷ lệ phát hiện cao hơn MY09/11 (42,44-46). Một bổ sung gần đây là xét nghiệm HPV Roche Amplicor ®, trong đó bao gồm loạt các gốc tạo ra một amplicon ~ 165-bp từ khu vực L1 của 13 loại HPV nguy cơ cao. Thử nghiệm chỉ ra một tương lai hứa hẹn (47), nhưng vẫn cần đến những thử nghiệm lâm sàng.
Cũng có phương pháp PCR mà khuếch đại ADN trong vùng E1 được bảo tồn bằng cách sử dụng 2 chất mồi (48).
+ Cách tiếp cận gốc E6
Chiến lược PCR này hướng vào mục tiêu là E6, E7 gây ung thư, một phần của virut (49-52), bởi vì vùng này chỉ ra những khác biệt lớn nhất trong trình tự nucleotide giữa các tuýp HPV khác nhau và luôn được giữ lại bởi các tế bào bị nhiễm. Mặc dù các biến đổi của chuỗi trong vùng E6 đã được báo cáo, chúng hầu như chỉ nằm trong vùng đầu tận cùng N (16), để các gốc PCR chỉ định trong nửa đầu tận cùng C sẽ xuất hiện thích hợp hơn. Trong phương pháp này, các gốc có loại hoặc nhánh cụ thể này có thể được thiết kế để không chỉ xác định với HPV dương tính, mà phân biệt được các tuýp HPV nguy cơ từ cao đến thấp, ví dụ, bằng cách tạo ra sản phẩm PCR khác nhau về kích thước đối với các tuýp có nguy cơ cao và thấp hoặc bằng cách sử dụng các chiến lược real-time PCR. Định lượng bằng real-time PCR có thể cung cấp tất cả các thông tin quan trọng về lượng virus với ý nghĩa tiên lượng (53). Việc phân nhóm HPV dựa trên sự tương đồng trình tự giữa các vùng E6 của HPV tương quan với khác biệt lâm sàng (54), dẫn tới sự hỗ trợ cho việc sử dụng các chất mồi đặc hiệu theo nhóm nguy cơ. Giá trị của phương pháp này đã được xác nhận (55) và cung cấp một phương tiện trực tiếp để thu được các loại thông tin cần thiết cho việc ra quyết định lâm sàng. Tất cả các loại HPV chủ yếu hiện nay đã được biết, do đó chất mồi thích hợp hướng vào vùng E6/E7 thuộc các loại khác nhau, và có khả năng cho biết liệu một người phụ nữ có bị nhiễm HPV nguy cơ cao không, có thể được tổng hợp và dễ dàng tích hợp vào cùng một ống phản ứng. Trong thực tế có giới hạn trong việc mở rộng ghép kênh, do đó, một loạt các ống phản ứng với các bộ khác nhau của chất mồi có thể dẫn đến độ tin cậy lớn hơn . Việc sử dụng các chất mồi E6/E7 làm cho cơ hội bỏ sót lây nhiễm khó xảy ra. Chi phí cũng thấp hơn, do cần ít bước hơn. Do đó, xét nghiệm E6 có thể hấp dẫn hơn trong việc tầm soát rộng rãi so với phương thức tiếp cận L1. Hơn nữa, quá trình này nhấn mạnh là bất kỳ xét nghiệm HPV nào cũng chỉ nên phát hiện tuýp HPV nguy cơ cao (56). Ít nhất một bộ PCR thương mại hướng vào vùng E6/E7 đã được phát triển (52) .
+ Các nghiên cứu so sánh chất mồi L1 và E6
Lợi thế của việc nhắm đến vùng E1 hoặc L1 là điều này có khả năng phát hiện nhiều, có lẽ là tất cả, các tuýp HPV. Bất lợi chủ yếu mà có lẽ không xảy ra đó là nếu virut chỉ hiện diện duy nhất ở dạng tích hợp, thực tế xảy ra đối với nhiều bất thường tiến triển. Như vậy, đích của PCR có thể không hiện diện ở các vùng khác ngoài E6 và E7. Mặt khác, việc hướng vào các vùng E6 E7 sẽ phát hiện tất cả các mẫu nhiễm HPV nguy cơ cao, miễn là sử dụng chất mồi cho tất cả các loại HPV liên quan. Phương pháp phát hiện ảnh hưởng mạnh mẽ đến tỷ lệ phát hiện HPV đã được nhấn mạnh trong một nghiên cứu về ung thư hậu môn, trong đó người ta thấy rằng phương pháp ít nhạy cảm nhất để phát hiện HPV là PCR sử dụng chất mồi liên ứng L1 (tỷ lệ 16 %), trong khi chất mồi đặc hiệu theo tuýp nhắm vào vùng E6 mang lại kết quả dương tính là 46% (57).
PCR L1 có thể phát hiện phần lớn các trường hợp có các loại HPV nguy cơ thấp 6 hoặc 11, nhưng có thể đánh giá không đúng mức sự nhiễm HPV tuýp nguy cơ cao 16 hoặc 18. Phân mảnh của mẫu ADN trong các mô cố định bằng formalin đã được xem xét (58), và sự nhất quán của khuếch đại ADN HPV từ các mẫu này đã được báo cáo (57). Mặc dù một PCR L1 mang lại amplicon 450 bp, chất mồi đặc hiệu theo loại tạo ra sản phẩm PCR 380-440 bp từ mẫu vật cố định bằng formalin. Giải thích hợp lý hơn được cho là sự mất ADN gen HPV sau khi tích hợp, cụ thể là sự đứt đoạn của L1 và L2 (57). Sự mất sao chép từ các vùng này đã thực sự được chứng minh trong các tế bào bị nhiễm HPV16 (59). Mặc dù sự hiếm có khả năng dương tính của các protein vỏ bên ngoài virut trong quá trình tạo u hậu môn sinh dục trong biểu mô và xâm lấn (18,60) có thể là do sự mất L1, phiên mã của gen L1 thường bị giới hạn trong biểu mô không biệt hoá của CIN mức độ cao và ung thư cổ tử cung, do sự ngăn chặn chéo của E2 hoặc cơ chế không rõ.
Trái ngược với L1, đối với một loại HPV nhất định, các gen E6 và E7 được bảo tồn cao (28,30,31,59) và người ta cho rằng sự nhiễm HPV vì thế có thể phát hiện được ở hầu hết các trường hợp có sự hiện diện ADN virut (57).
Trong một nghiên cứu toàn diện giải quyết vấn đề này, một loạt các bộ chất mồi liên ứng đã được thử nghiệm, kể cả các chất mồi hướng vào các phần khác nhau của vùng L1 , tức là My09-My11, Gp5-Gp6, Gp5 + -Gp6 + , và oli-1b- oli-2I, và các chất mồi hướng vào vùng E1, tức là CpI- CpIIG (37). Bằng cách kiểm tra với tất cả các cặp chất mồi, cũng như chất mồi hướng vào vùng E6 hoặc E7, 98% của 355 mẫu sinh thiết từ các bệnh nhân ung thư cổ tử cung xâm lấn đã được thấy là dương tính với HPV. Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ một bộ đã đưa ra một tỷ lệ phát hiện thấp hơn nhiều. Thật thú vị khi lưu ý rằng chất mồi đặc hiệu theo loại (HPV 11 ,16, 18, 31, 33 và 35) phát hiện bệnh nhân nhiễm HPV nhiều hơn so với bộ chất mồi liên ứng nhạy cảm nhất. Trong thực tế, cần thiết phải sử dụng một số bộ chất mồi liên ứng cùng nhau (tức là, các bộ My, Gp/Gp +, và Cp) để phát hiện một số lượng lớn bệnh nhân dương tính với HPV. Hơn nữa, dựa trên kết quả sử dụng chất mồi liên ứng, sự mất đoạn L1 đã hiện diện ở 23 trong số 56 (41%) mẫu. Các dữ liệu tranh luận mạnh mẽ chống lại độ tin cậy của việc sử dụng duy nhất một chất mồi liên ứng L1. Mất đoạn có nghĩa là không phải tất cả chất mồi liên ứng sẽ có mục tiêu lai hóa trong ADN HPV, dẫn đến kết luận là sự kết hợp các chất mồi liên ứng phải được bao gồm trong bất kỳ xét nghiệm PCR nào có hy vọng phát hiện tất cả hoặc hầu hết HPV hiện diện trong một mẫu (35).
Trong các nghiên cứu khác, bao gồm 635 [436 (61) và 199 (62)] mẫu ung thư cổ tử cung từ Tây Ban Nha, Columbia, và Brazil, HPV chỉ được phát hiện trong 85 % mẫu sử dụng chỉ một bộ chất mồi liên ứng. Một tỷ lệ thấp hơn (69%) xuất hiện từ một nghiên cứu liên quan đến chất mồi My L1 (63). Thật vậy, dường như có đồng thuận rằng việc sử dụng một trong hai phương pháp MY- PCR hoặc GP + -PCR sẽ đánh giá thấp suất độ thực sự của HPV trong các mẫu cổ tử cung (37,64).
So sánh một xét nghiệm PCR liên ứng E6/E7 với xét nghiệm L1 chất mồi liên ứng MY cho thấy rằng 76 trong số 83 mẫu (92%) đã cho kết quả phù hợp (52). Chỉ có một là dương tính bởi E6/E7, nhưng âm tính bởi MY09/11. Mặt khác, sáu mẫu dương tính chỉ bằng L1. Điều này có thể do xét nghiệm MY có thể phát hiện 25 HPV, trong khi xét nghiệm E6/E7 đặc biệt được sử dụng chỉ có thể phát hiện tám. So sánh của thử nghiệm E7 với thử nghiệm dựa trên chất mồi lồng được cải biến bằng L1 ( MY11/GP6 + và GP5 + / GP6 +) trong 152 mẫu cho thấy thử nghiệm E7 nhạy cảm hơn và tỷ lệ phát hiện cao hơn (65). Như đã đề cập trong đánh giá hiện tại, các tác giả cũng chỉ ra rằng hầu hết các bệnh ung thư cổ tử cung dương tính với HPV18 chỉ chứa ADN HPV tích hợp (6,20), cho thấy rằng một trong số những nguyên nhân cơ bản của âm tính giả là các trường hợp mất đoạn hoặc tích hợp ảnh hưởng đến các trình tự L1 và E1, và sự gián đoạn trong vùng L1 xảy ra thường xuyên hơn đối với HPV18 so với nhiều loại HPV khác (1,2). Trong một nghiên cứu gồm 69.290 mẫu, sự thiếu khuếch đại tất cả các tuýp HPV khi sử dụng phương pháp MY09/11 khiến các tác giả phải thử lại các mẫu xét nghiệm âm tính bằng PCR đặc hiệu theo tuýp E7 (66). Trong các tuýp được xét nghiệm, phương pháp này cho thấy HPV51 là loại thường gặp nhất không được phát hiện bằng chất mồi liên ứng (72%), tiếp theo là các loại 39 (12%), 18 và 35 (7%) và 66 (3%). Cùng với sự thiếu tính đặc hiệu đối với các loại HPV nhất định (42), các tác giả này cho là sự mất L1 do tích hợp (1) là một khả năng khác, đặc biệt đối với HPV18.
Với các bằng chứng trên, có vẻ là sử dụng chất mồi hướng vào vùng E6/E7 của tất cả các loại HPV nguy cơ cao thường gặp, chiến lược PCR này biểu hiện cho xét nghiệm chẩn đoán chính xác nhất.
4. Ý kiến chuyên gia
Mặc dù các bằng chứng cho thấy rằng sự tích hợp có thể là một bước quan trọng trong quá trình tiến triển đến ác tính, nó là sự kiện tích hợp mà đôi khi có thể đặt ra thách thức đối với phương pháp tiếp cận PCR có liên quan đến chất mồi hướng vào vùng L1. Điều này làm tăng nỗi ám ảnh về việc bỏ sót HPV trong thử nghiệm bằng phương pháp PCR nếu chất mồi đang hướng vào vùng đột biến hoặc biến đổi khác, ngay cả khi vùng này không bị mất đoạn. Có nghĩa là, cả sự mất đoạn và các đột biến đã đặt ra vấn đề cần xem xét nghiêm túc khi nhắm đến vùng L1 sử dụng phương pháp PCR liên ứng. Điều này ít có khả năng xảy ra đối với vùng E6 hoặc E7, bởi vì bất kỳ đột biến nào cũng có thể có những tác động chức năng, rất có thể có hại cho hoạt tính gây ung thư của virut, do đó, các nhánh không phát hiện có thể sẽ không quan trọng. Và các vị trí chứa đột biến đã được biết làm gia tăng tiềm năng gây ung thư cần được tránh khi thiết kế chất mồi. Trong thực tế, đối với một loại HPV nhất định, có ''sự bảo tồn đặc biệt của trình tự ADN E6/E7'' (30). Điều này rất có ý nghĩa, bởi vì nó có nghĩa là chất mồi đặc hiệu hướng vào vùng E6 có khả năng ủ lớn hơn rất nhiều so với chất mồi “liên ứng” hướng đến vùng L1. Ý nghĩa của những phát hiện này là trong khi sàng lọc những phụ nữ bị CIN có thể sẽ phát hiện hầu hết nhiễm HPV khi chất mồi L1 được sử dụng cho PCR, một số phụ nữ có tổn thương tiến triển hơn có thể bị bỏ sót vì sự mất L1 trong quá trình tích hợp. Và đó là những phụ nữ đặc biệt cần được chẩn đoán chính xác, vì nhu cầu điều trị của họ lớn hơn và gấp hơn.
Một vấn đề phổ biến hơn là các chất mồi thoái biến được sử dụng để khuếch đại trình tự L1 không phải 100% đáng tin cậy, do sự biến đổi trình tự lớn hơn trong vùng này của bộ gen HPV, khi so với E6, và do đó có thể không lai hóa hoặc dẫn đến mồi sai. Mặt khác, sự độc đáo của E6 giữa các tuýp HPV khác nhau có nghĩa là việc phát hiện HPV bằng chất mồi E6 đòi hỏi phương pháp PCR đặc hiệu cho từng tuýp HPV, do đó làm tăng thêm khối lượng công việc và chi phí. Các vấn đề liên quan đến chất mồi liên ứng L1 có xu hướng dẫn đến bộ chất mồi đặc hiệu theo loại lớn. Do khả năng mất L1, dường như nhạy cảm hơn khi sử dụng đầu tay các chất mồi hướng vào vùng E6/E7.
Như vậy, tính liên tục của các dạng ADN HPV là có thật. Dạng bổ sung có xu hướng đại diện cho sự nhiễm HPV sớm hoặc CIN1, và, với sự tiến triển đến ung thư, tần suất HPV tích hợp tăng lên. Việc xác định tỷ lệ của mỗi dạng có thể đại diện cho một hướng dẫn sơ bộ đến giai đoạn của bệnh lý cổ tử cung liên quan HPV. Hơn nữa, do vùng E6/E7 được bảo tồn và các vùng L1/E2 có xu hướng bị mất đoạn khi bệnh tiến triển, việc định lượng tương đối của biểu hiện E6 và/hoặc E7 và biểu hiện L1 và/hoặc E2 có thể giúp đưa ra:
- Đánh giá về giai đoạn của bệnh có nguồn gốc từ HPV;
- Đánh giá nguy cơ của bệnh có nguồn gốc từ HPV ở phụ nữ bị nhiễm; và
- Cách thức phân loại hoặc phân giai đoạn phụ nữ bị nhiễm HPV, nhưng không phát hiện bị bệnh có nguồn gốc từ HPV, vào nhóm nguy cơ tiến triển thành bệnh và nhóm không có nguy cơ tiến triển thành bệnh.
Tuy nhiên, do 37-71% ung thư cổ tử cung có ADN HPV dạng bổ sung, việc phát hiện nhiễm HPV dai dẳng có thể quan trọng hơn việc phát hiện tích hợp ADN HPV để đánh giá nguy cơ hoặc giai đoạn của bệnh có nguồn gốc từ HPV ở một phụ nữ bị nhiễm.
5. Triển vọng
Việc phát hiện HPV được chấp nhận rộng rãi là đáng tin cậy hơn so với xét nghiệm tế bào học (Papanicolou smear – phết tế bào cổ tử cung) trong sàng lọc ung thư cổ tử cung. Kể từ khi PCR “được cấp bằng sáng chế” vào ngày 28 tháng 3 năm 2005, theo phạm vi bảo hộ bằng sáng chế của vùng HPV E6 tại Hoa Kỳ và châu Âu năm 2008, và toàn bộ bộ gen HPV tại Úc trong cùng một năm, việc sử dụng PCR trong quy trình xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng đã phát triển khá nhanh. Tốc độ, độ chính xác, độ tin cậy, khả năng được chấp nhận, sự quen thuộc và chi phí thấp của HPV PCR đã giúp nó trở thành một phương tiện chính trong sàng lọc ung thư cổ tử cung định kỳ trong vòng vài năm. Trên thực tế, độ nhạy và giá trị tiên đoán dường như tương đương với tiêu chuẩn vàng, soi cổ tử cung (47). Để đạt được điều này, quan trọng là chiến lược sử dụng PCR đáng tin cậy nhất trên lâm sàng được thông qua.
6. Điểm nổi bật
Các chiến lược PCR HPV hướng đến vùng E6/E7 có thể là được ưa chuộng hơn so với vùng L1 bởi các lý do sau:
- E6 và E7 là các vùng sinh ung của HPV;
- E6 và E7 được bảo tồn sau khi nhiễm bệnh, trong khí E2 và L1 có thể bị mất đoạn;
- E6 và E7 cho thấy khả năng bảo tồn tŕnh tự mạnh mẽ, không giống các vùng khác như L1;
- Sự đồng nhất của tŕnh tự E6 đối với mỗi tuýp HPV nghĩa là ít có khả năng xảy ra sự ghép sai chất mồi trong PCR;
- Tŕnh tự E6/E7 khác nhau giữa các tuýp HPV nguy cơ cao và nguy cơ thấp, do đó tạo ra sự khác biệt chẩn đoán bằng cách sử dụng PCR để xét nghiệm; và
- Việc lựa chọn tổng thể E6/E7 có thể mang lại lựa chọn tối ưu cho PCR.
Tài liệu tham khảo
1. Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch F, Kummer JA, Shah KV, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189:12–9.
2. Bosch FX, Manos MM, Munoz M, Sherman M, Jansen AM, Peto J, et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.
3. Turek LP. The structure, function, and regulation of papillomaviral genes in infection and cervical cancer. Adv Virus Res 1994;44:305–56.
4. Dowhanick JJ, McBride AA, Lowly PM. Suppression of cellular proliferation by the papillomavirus E2 protein. J Virol 1995;69:7791–9.
5. Kobayashi Y, Yoshinouchi M, Tianqi G, Nakamura K, Hongo A, Kamimura S, et al. Presence of human papillomavirus DNA in pelvic lymph nodes can predict unexpected recurrence of cervical cancer in patients with histologically negative lymph nodes. Clin Cancer Res 1998;4:979–83.
6. Cullen AP, Reid R, Campion M, Lorincz A. Analysis of the physical state of different human papillomavirus DNAs in intraepithelial and invasive cervical neoplasms. J Virol 1991;65:606–12.
7. Das BC, Sharma JK, Gopalakrishna V, Luthra UK. Analysis by polymerase chain reaction of the physical state of human papillomavirus type 16 DNA in cervical preneoplastic and neoplastic lesions. J Gen Virol 1992; 73:2327–36.
8. Boshart M, Gissmann L, Ikenberg H, Kleinheinz A, Scheurlen W, zur Hausen H. A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervical cancer. EMBO J 1984;3:1151–7.
9. Howley PM. Presence and expression of human papillomavirus sequences in human cervical carcinoma cell lines. Am J Pathol 1985;119:361–6.
10. Yee C, Krishnan-Hewlett I, Backer CC, Schlegal R, Howley PM. Presence and expression of human papillomavirus sequences in human cervical carcinoma cell lines. Am J Pathol 1985;119:361–6.s - uncorrected proof
11. Tsunokawa Y, Takebe N, Nozawa S, Kasamatsu T, Gissmann L, zur Hausen H, et al. Presence of human papillomavirus type-16 and type-18 DNA sequences and their expression in cervical cancers and cell lines from Japanese patients. Int J Cancer 1986;37:499–503.
12. Vernon DD, Unger ER, Miller DL, Lee DR, Reeves WC. Association of human papillomavirus type 16 integration in the E2 gene with poor disease-free survival from cervical cancer. Int J Cancer 1997;74:50–6.
13. Du¨ rst M, Kleinheinz A, Hotz M, Gissman L. The physical state of human papillomavirus type 16 DNA in benign and malignant genital tumours. J Gen Virol 1985;66: 1515–22.
14. Yiu KC, Huang DP, Chan MK, Foo W. The physical state of human papillomavirus type 16 DNA in cervical carcinomas of Hong Kong Chinese. Oncogene 1991;6: 1339–42.
15. Matsukura T, Koi S, Sugase M. Both episomal and integrated forms of human papillomavirus type 16 are involved in invasive cervical cancers. Virology 1989; 172:63–72.
16. Watts KJ, Thompson CH, Cossart YE, Rose BR. Sequence variation and physical state of human papillomavirus type 16 cervical cancer isolates from Australia and New Caledonia. Int J Cancer 2002;97:868–74.
17. Peitsaro P, Johansson B, Syrjanen S. Integrated human papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique. J Clin Microbiol 2002; 40:886–91.
18. Schwarz E, Freese U, Gissmann L, Mayer W, Roggenbuck B, Stremlau A, et al. Structure and transcription of human papillomavirus sequences in cervical carcinoma cells. Nature 1985;314:111–14.
19. Fukushima M, Yamakawa Y, Shimano S, Hashimoto M, Sawada Y, Fujinaga K. The physical state of human papillomavirus 16 DNA in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia. Cancer 1990;66:2155–61.
20. Park JS, Hwang ES, Park SN, Ahn HK, Um SJ, Kim CJ, et al. Physical status and expression of HPV genes in cervical cancers. Gynecol Oncol 1997;65:121–9.
21. Pfister H, Fuchs PG. Relation of papillomaviruses to anogenital cancer. Dermatol Clin 1991;9:267–76.
22. Shirasawa H, Tomita Y, Kubota K, Kasai T, Sekiya S, Takamizawa H, et al. Detection of human papillomavirus type 16 DNA and evidence for integration into the cell DNA in cervical dysplasia. J Gen Virol 1986;67:2011–5.
23. Andersson S, Safari H, Mints M, Lewensohn-Fuchs I, Gyllensten U, Johansson B. Type distribution, viral load and integration status of high-risk human papillomaviruses in pre-stages of cervical cancer (CIN). Br J Cancer 2005;92:2195–200.
24. Shirasawa H, Tomita Y, Sekiya S, Takamizawa H, Simizu B. Integration and transcription of human papillomavirus type 16 and 18 sequences in cell lines derived from cervical carcinomas. J Gen Virol 1987;68:583–91.
25. Choo KV, Pan CC, Han SH. Integration of human papillomavirus type 16 into cellular DNA of cervical carcinoma: preferential deletion of the E2 gene and invariable retention of the long control region and the E6/E7 open reading frames. Virology 1987;161:259–61.
26. Matsukura T, Kanda T, Furuno A, Yoshikawa H, Kawana T, Yoshiike K. Cloning of monomeric human papillomavirus type 16 DNA integrated within cell DNA from a cervical carcinoma. J Virol 1986;58:979–82.
27. Schneider-Maunoury S, Croissant O, Orth G. Integration of human papillomavirus type 16 DNA sequences: a possible early event in the progression of genital tumours. J Virol 1987;61:3295–8.
28. Wagatsuma M, Hashimoto K, Matsukura T. Analysis of integrated human papillomavirus type 16 DNA in cervical cancers: amplification of viral sequences together with cellular flanking sequences. J Virol 1990;64:813–21.
29. Jeon S, Allen-Hoffmann BL, Lambert PF. Integration of human papillomavirus type 16 into the human genome correlates with a selective growth advantage of cells. J Virol 1995;69:2989–97.
30. Cone RW, Minson AC, Smith MR, McDougall JK. Conservation of HPV-16 E6/E7 ORF sequences in a cervical carcinoma. J Med Virol 1992;37:99–107.
31. Baker CC, Phelps WC, Lindgren V, Braun MJ, Gonda MA, Howley PM. Structural and transcriptional analysis of human papillomavirus type 16 sequences in cervical carcinoma cell lines. J Virol 1987;61:962–71.
32. Choo KB, Lee HH, Pan CC, Wu SM, Liew LN, Cheung WF, et al. Sequence duplication and internal deletion in the integrated human papillomavirus type 16 genome cloned from a cervical carcinoma. J Virol 1988;62: 1659–66.
33. Jeon S, Lambert PF. Integration of human papillomavirus type 16 DNA into the human genome leads to increased stability of E6 and E7 mRNAs: implications for cervical carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:1654–8.
34. Romanczuk H, Thierry F, Howley PM. Mutational analysis of cis elements involved in E2 modulation of human papillomavirus type 16 P99 and type 18 P105 promoters. J Virol 1990;64:5240–9.
35. Thierry F, Howley PM. Functional analysis of E2 mediated repression of the HPV 18 P105 promoter. New Biol 1991;3:90–100.
36. Bernard BA, Bailly C, Lenoir MC, Darmon M, Thierry F, Yaniv M. The human papillomavirus type 18 (HPV18) E2 gene product is a repressor of the HPV 18 regulatory region in human keratinocytes. J Virol 1989;63:4317–24.
37. Karlsen F, Kalantari M, Jenkins A, Pettersen E, Kristensen G, Holm R, et al. Use of multiple PCR primer sets for optimal detection of human papillomavirus. J Clin Microbiol 1996;34:2095–100.
38. Manos MM, Ting Y, Wright DK, Lewis AJ, Broker TR, Wolinsky SM. The use of polymerase chain reaction amplification for the detection of genital human papillomaviruses. Cancer Cells 1989;7:209–14.
39. de Roda Husman AM, Walboomers JM, van den Brule AJ, Meijer CJ, Snijders PJ. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 39 ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J Gen Virol 1995;76:1057–62.
40. Snijders PJ, van den Brule AJ, Schrijnemakers HF, Snow G, Meijer CJ, Walboomers JM. The use of general primers in the polymerase chain reaction permits the detection of a broad spectrum of human papillomavirus genotypes. J Gen Virol 1990;71:173–81.
41. Hildesheim A, Schiffman MH, Gravitt PE, Glass AG, Greer CE, Zhang T, et al. Persistence of type-specific human papillomavirus infection among cytologically normal women. J Inf Dis 1994;169:235–40.
42. Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ, Wheeler CM, Coutlee F, Hildesheim A, et al. Improved amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol 2000;38: 357–61.
43. Qu W, Jiang G, Cruz Y, Chang CJ, Ho GY, Klein RS, et al. PCR detection of human papillomavirus: comparison between MY09/MY11 and GP5q/GP6q primer systems.
J Clin Microbiol 1997;35:1304–10.
44. Coutle´ e F, Gravitt P, Kornegay J, Hankins C, Richardson H, Lapointe N, et al. Use of PGMY primers in L1 consensus PCR improves detection of human papillomavirus DNA in genital samples. J Clin Microbiol 2002;40:902–7.
45. Kleter B, van Doorn LJ, ter Schegget J, Schrauwen L, van Krimpen K, Burger M, et al. Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 1998;153:1731–9.
46. Perrons C, Kleter B, Jelley R, Jalal H, Quint W, Tedder R. Detection and genotyping of human papillomavirus DNA by SPF10 and MY09/11 primers in cervical cells taken from women attending a colposcopy clinic. J Med Virol 2002;67:246–52.
47. Monsonego J, Bohbot JM, Pollini G, Krawec C, Vincent C, Merignargues I, et al. Performance of the Roche AMPLICOR_ Human papillomavirus (HPV) test in prediction of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) in women with abnormal PAP smear. Gynecol Oncol 2005; July.
48. Gregoire L, Arella M, Campione-Piccardo J, Lancaster WD. Amplification of human papillomavirus DNA sequences by using conserved primers. J Clin Microbiol 1989;27:2660–5.
49. Morris BJ, Flanagan JL, McKinnon KJ, Nightingale BN. Papillomavirus screening of cervical lavages by polymerase chain reaction. Lancet 1988;ii:1368.
50. Dallas PB, Flanagan JL, Nightingale BN, Morris BJ. Polymerase chain reaction for fast, nonradioactive detection of high- and low-risk papillomavirus types in routine cervical specimens and in biopsies. J Med Virol 1989; 27:105–11.
51. Morris BJ, Rose BR, Flanagan JL, McKinnon KJ, Loo CY, Thompson CH, et al. Automated polymerase chain reaction for papillomavirus screening of cervicovaginal lavages: comparison with dot-blot hybridization in a sexually transmitted diseases clinic population. J Med Virol 1990;32:22–30.
52. Venturoli S, Bonvicini F, Cricca M, Gallinella G, Giosa F, Farinazzo F, et al. Evaluation of commercial kits for the detection and typing of human papillomavirus in cervical swabs. J Virol Methods 2002;105:49–56.
53. Schlecht NF, Trevisan A, Duarte-Franco E, Rohan TE, Ferenczy A, Villa LL, et al. Viral load as a predictor of the risk of cervical intraepithelial neoplasia. Int J Cancer 2003;103:519–24.
54. Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenberg MD, Lancaster W, Kurman RJ. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol 1992;79:328–37.
55. Fujinaga Y, Shimada M, Okazawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K. Simultaneous detection and typing of genital human papillomavirus DNA using the polymerase chain reaction. J Gen Virol 1991;72:1029–44.
56. Molijn A, Kleter B, Quint W, van Doorn LJ. Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol 2005;32(Suppl 1):S43–S51.
57. Noffsinger AE, Suzuk L, Hui YZ, Gal AA, Fenoglio-Preiser CM. Differential sensitivities of E6 type-specific and L1 consensus primers in the detection of human papillomavirus in anal carcinoma. Mod Pathol 1995;8:509–14.
58. Park JS, Leake JF, Sharma BK, Toki T, Kessis TD, Ambros RA, et al. Variability in b-globin and HPV DNA amplification by PCR from fixed tissues. Mod Pathol 1991;4:667–70.
59. Stoler MH, Rhodes CR, Whitbeck A, Wolinsky SM, Chow LT, Broker TR. Human papillomavirus type 16 and 18 gene expression in cervical neoplasias. Human Pathol 1992;23:117–28.
60. Du¨ rst M, Gallahan D, Jay G, Rhim JS. Glucocorticoidenhanced neoplastic transformation of human keratinocytes by human papillomavirus type 16 and an activated as oncogene. Virology 1989;173:767–71.
61. Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Tafur L, Izarzugaza I, Gili M, et al. The causal link between human papillomavirus and invasive cervical cancer: a population-based case-control study in Colombia and Spain. Int J Cancer 1992;52:743–9.
62. Eluf-Neto J, Booth M, Munoz N, Bosch FX, Meijer CJ, Walboomers JM. Human papillomavirus and invasive cervical cancer in Brazil. Br J Cancer 1994;69:114–9.
63. Guerrero E, Daniel RW, Bosch FX, Castellsague X, Munoz N, Gili M, et al. Comparison of ViraPap, Southern hybridization, and polymerase chain reaction methods for human papillomavirus identification in an epidemiological
investigation of cervical cancer. J Clin Microbiol 1992;30:2951–9.
64. Smits HL, Bollen LJ, Tjong-A-Hung SP, Vonk J, Van Der Velden J, Ten Kate FJ, et al. Intermethod variation in detection of human papillomavirus DNA in cervical smears. J Clin Microbiol 1995;33:2631–6.
65. Huang L-W, Chao S-L, Chen P-H, Chou H-P. Multiple HPV genotypes in cervical carcinomas: improved DNA detection and typing in archival tissues. J Clin Virol 2004;29:271–6.
66. Depuydt CE, Vereecken AJ, Salembier GM, Vanbrabant AS, Boels LA, van Herck E, et al. Thin-layer liquid-based cervical cytology and PCR for detecting and typing human papillomavirus DNA in Flemish women. Br J Cancer 2003;88:560–6.
